FVIII/ET3 이식

Nature Communications 14권, 기사 번호: 4206(2023) 이 기사 인용

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혈우병 A는 전 세계적으로 50만 명 이상의 개인에게 영향을 미치는 가장 흔한 X-연관 출혈 장애입니다. 중증 혈우병 A 환자는 응고 FVIII 수치가 1% 미만이고 자발적으로 쇠약해지고 생명을 위협하는 출혈을 경험합니다. 혈우병 A 치료제의 발전으로 건강 결과가 크게 향상되었지만, FVIII 억제 항체의 개발과 치료 중 돌발 출혈로 인해 환자의 질병률과 사망률이 크게 증가했습니다. 여기에서 우리는 인간의 임신 기간 16~18주에 해당하는 양 태아를 사용하고, 최적화된 FVIII 단백질을 생산하도록 생체 공학적으로 설계된 인간 태반 세포(107~108/kg)의 출생 전 이식이 혈장 FVIII 수준을 상당히 상승시키는 결과를 가져온다는 것을 보여줍니다. 치료 후 3년 이상 지속됩니다. 세포는 주요 기관에 생착되며 수용자 중 어느 누구도 자신이 생산하는 세포나 FVIII에 면역 반응을 보이지 않습니다. 따라서 이러한 연구는 출생 전에 혈우병 A를 치료하는 것의 타당성, 면역학적 이점 및 안전성을 입증합니다.

가장 흔한 X-연관 출혈 장애인 혈우병 A(HA)는 남아 출생 100,000명당 24.6명에서 발생하며 전 세계적으로 50만 명이 넘는 사람에게 영향을 미칩니다1. 중증 HA(PHA) 환자는 정상 혈장 수준의 FVIII 활성이 1% 미만이며, 결합 조직/근육 혈종, 내부 출혈, 만성 쇠약성 관절병증으로 이어지는 혈관절증을 포함하여 생명을 위협하는 자연 출혈을 견뎌냅니다2. 치료 표준을 실질적으로 향상시킨 현재 치료법의 최신 발전에도 불구하고3 PHA의 질병 부담은 관절 질환으로 인해 노출 후 처음 50일 이내에 환자의 25~40%에서 억제 항체가 발생하는 등 계속해서 높습니다. FVIII로 전환하고, 돌발 및/또는 생명을 위협하는 출혈을 예방하는 것이 여전히 어려운 과제입니다4,5.

최근 연구에 따르면 혈우병을 갖고 태어난 사람이 정상적인 삶을 누릴 수 있는 기회는 고소득 국가에서는 33%, 저소득 국가에서는 93% 감소하는 것으로 나타났습니다1. 이러한 냉정한 통계는 이들 환자의 생존과 삶의 질을 향상시키기 위한 새로운 치료 접근법의 개발이 필요한 아직 충족되지 않은 긴급한 임상 요구가 있음을 보여줍니다.

자궁 내 이식(IUTx)을 사용하여 출생 전 기간 동안의 유전 질환 치료는 동정적 사용 하에 인간에게 수십 년 동안 안전하게 수행되었습니다6. 최근 α-지중해빈혈(NCT02986698), 골형성 부전증(NCT03706482) 또는 리소좀 축적 질환(NCT04532047)이 있는 태아를 치료하기 위해 IUTx를 사용하는 안전성과 타당성을 확립하기 위해 피험자를 모집하는 임상 시험이 시작되었습니다. 이러한 시험은 단일 유전자 장애 환자를 치료할 수 있는 방법에 대한 관점에서 절실히 필요한 변화를 입증하고 임산부와 영향을 받은 피험자 모두에 대한 이러한 유형의 절차의 안전성을 더욱 확립했습니다7.

HA 환자의 약 70%는 이 질병의 가족력을 갖고 있으므로 산전 진단 및 중재가 가능합니다. 중증의 생명을 위협하는 출혈 장애를 경증 표현형으로 전환시키기에 충분하거나 완치 가능한 FVIII 수준을 제공하는 동시에 FVIII 제품에 대한 면역 내성을 유도하여 FVIII 억제제 형성 위험을 제거할 수 있는 산전 치료법의 개발 , HA 환자의 기대 수명과 삶의 질에 큰 유익한 영향을 미칠 것이며 HA 치료의 표준 치료를 변화시킬 것입니다8,9.

자궁 유전자 치료가 전임상 연구에서 큰 가능성을 보인 반면10, 시험관 내 세포 형질도입은 직접 벡터 주입으로는 가능하지 않은 생산 보호 조치를 허용하고 부주의하게 원하지 않는 조직/세포(예: 생식선의 조직/세포)를 형질도입하는 위험을 제거합니다. 또한, 생체 내에서 생리학적으로 증식하고 임상적으로 치료 수준의 FVIII을 분비하는 세포를 사용하는 IUTx는 HA6의 장기/영구 교정을 제공하기 위한 유망하고 안전한 접근법입니다. 우리는 최근 인간 태반 세포(PLC)가 골수성 코돈 최적화된 생체공학 FVIII(PLC-mcoET3)을 코딩하는 렌티벡터로 형질도입될 때 생체 내에서 FVIII을 생산하고 분비하는 탁월한 세포 플랫폼임을 보고했습니다. 여기서는 야생형 양을 IUTx의 대형 동물 모델로 사용하여 인간의 16~18 임신 주(gw)에 해당하는 PLC-mcoET3을 투여하면 대조군의 수준을 초과하는 혈장 FVIII 수준이 상승했음을 입증합니다. - 체중의 빠르고 상당한 증가에도 불구하고 출생 후 >3년 동안 IUTx 동물 >48.4 ± 12.3% 감소, 치료 관련 독성 증거 없음, 항FVIII/ET3 IgG, FVIII 억제제 발생 또는 ET3 특정 Th1 또는 Th2 세포. 또한, 우리는 IUTx 처리된 수용자가 이식된 인간 PLC에 대한 면역이나 항HLA 항체를 개발하지 않았지만 외국 항원에 대한 강력한 반응성을 유지한다는 것을 보여주었습니다. RNA 및 DNA 분석을 통해 모든 주요 기관에서 벡터로 인코딩된 mcoET3의 생착 및 지속적인 발현이 입증되었습니다. 이 치료법은 또한 어려운 출산에도 불구하고 HA 양의 출혈이 없는 결과를 가져왔습니다. 따라서 이러한 연구는 태아기 동안 HA 치료의 타당성, 면역학적 이점 및 안전성을 입증합니다.

2 SD above the mean OD from ELISAs performed with control sheep plasma (dotted line). During the first year post-IUTx, none of the treated animals developed anti-ET3 IgM or IgG antibodies, but during year 2, c a low-titer (1:20) anti-ET3 IgG antibody was detected in one animal (17010). This animal was closely followed with subsequent anti-ET3 IgG antibody testing, and data showed that (d) the anti-ET3 IgG antibody measured at different time points (n = 5) was either a transient non-inhibitor antibody, since FVIII levels remained high, or an assay artifact as subsequent samples from this animal were devoid of anti-ET3 IgG. Data are shown as Mean ± SEM. Source data are provided as a Source Data file./p>2, and >10 SFU/2 × 105 PBMC (dotted line). IUTx recipients (n = 13 animals) had no ET3-specific Th1 or Th2 lymphocytes, while their lymphocytes maintained the ability to react and secrete IFN-γ and IL-4 when stimulated with Phytohemagglutinin-L (PHA-L); c None of the IUTx animals’ (n = 13 animals) lymphocytes proliferated in the presence of same-donor PLC-mcoET3 (T) or same-donor non-transduced PLC (NT), when tested by one-way MLRs, but maintained significant proliferative response to third party human PBMC. For each animal, MLR assays were performed in triplicate at two different time points. Data are shown as Mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test was used to determine significant differences. p ≤ 0.05 was considered significant. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. Source data are provided as a Source Data file./p>

0.999; 0.1818; 0.8041; spleen p = 0.0763; 0.0702; 0.1244; >0.9999; 0.9906; 0.9854; lung p = 0.0845; 0.8127; 0.8366; >0.9999; thymus p = 0.9818; 0.8695; 0.0755; 0.144; 0.9785. Source data are provided as a Source Data file./p>30% of PHA develop FVIII inhibitors28,29. Importantly, both persons with severe30 and non-severe HA31 who develop inhibitors have an increased mortality risk. Also of note is that some patients can experience spontaneous bleeding starting during the neonatal period or infancy. Reports show that 9.5% of HA newborns need replacement treatment within the first 24 h after birth, and 44% have a bleeding episode by 1 mo.26,27. Moreover, infants suffer cranial (24%), oral (30%), soft tissue (7%), and joint (16.2%) bleeds26,27. Thus, even a 5% increase in FVIII activity during the neonatal period could avert early bleeding events. Therefore, these patients could greatly benefit from early intervention./p>48.4 ± 12.3%, for >3 years after birth. The FVIII activity levels determined by FVIII activity assays were also confirmed by LC-MS, which, in addition, demonstrated that ET3 protein was present in the plasma of treated animals. Furthermore, in seven out of eight animals, FVIII levels at 1-year post-IUTx did not differ significantly from those at 3 years post-IUTx, and the one animal in which levels of FVIII declined still maintained FVIII levels >5% above normal. Interestingly, higher plasma FVIII levels were not detected in animals that received higher cell doses, or cells with higher FVIII secretion. Importantly, none of the treated animals developed anti-FVIII/ET3 IgM or IgGs, or ET3-specific Th1 or Th2 cells. This is in contrast to what was reported in another study using juvenile sheep that received the exact same therapy (PLC-mcoET3) by the same administration route (IP), and in which 66% of animals developed anti-FVIII/ET3 IgGs and low titers of anti-FVIII and anti-ET3 inhibitory antibodies13./p>15% FVIII, which is intended to provide effective protection from the majority of spontaneous bleeds25. Since at 3 years after IUTx, the average plasma levels of FVIII were 48.4 ± 12.3% above the control, this approach could also provide enough factor to control other acute bleeds, in particular, subclinical bleeds and those associated with traumas, surgery, and/or intense physical activity25. Nevertheless, confirmation of phenotypic correction by evaluating whether the annualized bleeding rate is significantly reduced from baseline throughout the lifetime of HA animals, and evidence that an immune response is still not present in these animals is a must to ascertain the true clinical impact of this prenatal approach./p> 5 IU./p>

2 SD above the mean OD from control sheep plasma (n = 4) Supplementary Fig. 7a, b./p>

2 (Stimulation Index >2); and (2) a threshold minimum of 10 SFU/2 × 105 PBMC was reached./p>

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